非接触式扫描离子电导显微镜技术在探测活体细胞表面微结构中的应用

　　在细胞生物学研究中,连续高分辨率地研究活体细胞表面形貌将能更好地帮助人们深入了解细胞膜微观结构与其生理功能的关系。而如何实现实时高分辨率地探测活体细胞膜表面的微观结构与功能的变化,始终是当前纳米生物医学研究者所面临的挑战之一。连续观察细胞行为最常用的是光学显微镜,但传统光学显微镜由于受到光学衍射极限的限制,其用于生物样品探测的最高分辨率很难突破200 nm。常规扫描电子显微镜(scanning electronmicroscopy, SEM)尽管具有足够高的分辨率,但需要对生物样品进行固化等处理以实现样品的导电性,这在一定程度上会影响样品表面微观结构的原始状态,且不适合活体生物样品的实时动态观测。近年来出现了一系列利用探针与样品间的不同相互作用来探测纳米尺度下表面或界面性质的扫描探针显微镜技术(scanning probe microscopy, SPM),使纳米技术得到了迅猛发展,并成为人类认识微观世界的有力工具。原子力显微镜技术(atomic force microscopy,AFM)[1]就是一种已广泛应用于生命科学、物理学、材料科学等多个研究领域的SPM,并可高分辨率地研究生物样品的表面微观形貌。然而,AFM是以探针与样品间的相互作用力为负反馈信号来控制探针在样品表面的扫描,因此AFM扫描过程中其探针与生物样品表面间发生的轻微接触会对生物样品的活性及表面微结构产生或多或少的影响[2]。

　　1989年,美国加州大学的Hansma等人[3]在SPM负反馈基础上设计出了一种用于研究非接触式的扫描离子电导显微镜技术(scanning ion conductancemicroscopy, SICM)。其工作原理为当玻璃微探针接近样品表面时,空间距离的减小会限制离子自由流入玻璃微探针,离子电导随之减小,实时监测离子电导的变化并通过负反馈控制来维持流入探针离子电导的恒定,从而控制探针保持恒定距离(非接触地)在样品表面扫过,记录扫描探针的位置即可得到被测样品的三维拓扑形貌。但由于受到当时负反馈控制及技术的局限,扫描过程中的玻璃微探针经常与样品表面产生意外接触而破碎。直到1997年,英国伦敦帝国理工学院的Korchev教授[4,5]及其研究组将直流式负反馈控制改进为交流调制式负反馈控制,才使得SICM真正实现了对活体生物样品的非接触式实时探测。SICM不仅可实时高分辨率地研究各类活体细胞表面的三维微观结构,也可对细胞离子通道活性等生理功能进行研究,并逐步成为纳米生物学研究领域中具发展潜力及前景的一种扫描探针显微镜技术[6,7]。

　　本文简要介绍了SICM高分辨率生物样品探测用纳米尺度玻璃微探针的制备和功能评估;结合玻璃微探针与样品的接近曲线分析了SICM实现非接触式生物样品探测的基本原理;利用该显微镜技术高分辨率非接触式地研究了导电的扫描探针显微镜标样及非导电的活体肾上皮A6细胞的微观形貌,并用A6细胞膜的扫描电镜图像验证了SICM高分辨率成像所提供信息的可靠性。