实验室HPLC柱的填装

    1　实验部分

    1·1　仪器设备

    美国Waters公司高效液相色谱仪

    上海超声波仪器厂超声波仪

    北京市微电机总厂IA0512三相120W异步电动机

    自制匀浆罐

    Waters公司3·9×300mm空本管

    1·2　试剂

    2　HPLC色谱柱的填装步骤

    2·1　装柱前要对色谱柱管进行认真清洗,柱管浸泡在乙醇中,用超声波仪进行清洗。至内壁可以看到圈圈亮环无黑斑为止,然后自然风干。

    2·2　如图1所示连接好装置,打开压力泵逐渐开压观察压力表指示变化,用滤纸检测密封系统各接头的密封情况。如:有泄漏及时进行调整。压力表达到50MPa时关闭高压泵进行敝压实验,调整装置各部分,以压力不再降低为准。

    2.3.称取2.3 ~2.4g填料,置于小烧杯中,加入适量的分散介质(40%二氧六环∶60%四氯化碳),在超声波中处理,直至得到半透明的分散均匀的匀浆液为止。

    2·4　打开匀浆罐上口,缓慢加入适量分散介质充满色谱柱,再将匀浆液倾入匀浆罐中,封好匀浆罐上口。

    2·5　打开匀浆罐上方龙头,打开高压泵进行排气。当匀浆罐上方龙头有液体流出时,说明排气完毕,关闭开口。

    2·6　迅速提高高压泵冲量,使压力迅速上升,当压力表即将达到50MPa时迅速将高压泵冲量降低,使压力维持在50MPa左右,保持2小时。

    2·7　压力表不再发生变化,可认为柱中填料紧密程度不再改变,极缓慢地降低加压介质流速至零,停泵。

    2·8　待柱中不再有加压介质流出后,卸下柱子,用刀片仔细削平顶端填料,装上滤片及柱接头,将柱子入口和出口标示清楚,柱子两端用螺母密封好。

    2·9　将色谱柱换到HPLC仪上,用流动相来平衡,用自动记录仪来观察平衡情况。

    2·10　平衡好后向HPLC仪中注射苯、甲苯、二甲苯试剂,根据峰形进行评估。

    3　装柱结果及评价

    理论塔板数与粒度成反比,即粒度越小理论塔板数越高,反相柱粒度在10um左右,故预计要达到较理想的分离性能所填装的色谱柱理论塔板数应是7000块/300mm以上。本次实验共装2根反相柱,均达到预期效果,现将色谱柱评价结果分析如下。

    评价公式:

    3·1　99-5-1号柱样

    半峰宽:0.465mm

    纸速:5cm/min

    保留时间:4.355min

     评价:峰分离较好,且峰形对称因而可以用上述公式计算。

    3·2　99-5-2号柱样

    半峰宽:0.465mm

    保留时间:4.168min

    代入公式:

计算　N=11127,见图3。

    评价:以苯作为柱效评价标准从图上可以看出峰形对称,所以可用上述公式进行计算。