细胞显微荧光定量分析系统的设计与研制

　  细胞荧光技术是在荧光显微镜下观测受到激发光照射的细胞荧光影像,从而获得普通可见光显微镜显示不出的有关细胞结构.细胞内外所含的特定生物物质的信息是现代医学基础理论和生物学、遗传学研究及医学临床分析工作中极有用的手段.为开发细胞物质定性和定量分析检测技术,已陆续开发出若干种细胞显微荧光分析系统.本文的研究方向是设计开发新颖、有效、实用、廉价的细胞显微荧光分析系统,并在小鼠精子细胞倍体关系检测及神经细胞内钙离子测定等方面获得满意的应用效果.

1　显微荧光定量分析和细胞物质检测原理

1.1　显微荧光定量分析基础

　　荧光物质受到短波光照射后被激发至高能态、经无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级,然后以发射荧光方式跃迁回基态各能级,发射荧光强度与该物质的吸光能力及其荧光量子产率有关.参见图1设试样物质中dx薄层吸收的光强为dI,则荧光发射强度为

由此式可知,对某种荧光物质的稀试样,在一定波长、一定强度激发光下所产生的荧光强度正比于该物质的浓度,这就是荧光分析的定量基础.

　　相对于通常的吸收光谱分析术,荧光分析术有两个优点:

　　1)吸收光谱分析的测定值是在相当大的入射光强度基础上的相对较小的光强衰减量,荧光分析测定值则是暗背景上的荧光发射量,因而荧光分析的检测信噪比高,通常可以达到10^-11～10^-12g的检出限;

　2)由于荧光吸收和发射的波长选择性明显(特定荧光物质只能吸收确定波长的入射光能,发射特定波长的荧光),因而荧光分析的选择性极好,干扰影响极小,分析可靠性好.

1.2　细胞内物质荧光定量检测机理

　　细胞构成物质成分是生物体存活及其生物物理-化学过程正常进行的物质基础,例如神经细胞内游离钙离子浓度的变化直接决定了神经细胞的生物学与病理学过程的变化或导致神经细胞的死亡.生物学和医学研究已经充分证明,诸如脑缺血、缺氧、癫痫、巴金森氏病、早老性痴呆等等脑神经系统疾病都直接与细胞内钙离子浓度变化有关.

　　细胞内物质浓度定性定量分析可采用各种技术和仪器手段.以细胞内游离钙离子浓度定量分析为例,理论分析和实验结果都证明采用适当的有关指示剂与特定的检测对象(游离钙离子)结合,进行实时显微荧光定量分析,是结果最理想、分析过程最快捷、经济的分析手段.

　　就细胞内游离钙离子定量分析而言,可以采用荧光指示剂Fura 2与胞浆中的游离Ca2+结合而实施细胞显微荧光定量分析.

荧光指示剂与Ca2+的结合是化学平衡过程