关于生化自动分析仪波长选择的几点讨论

　　1 引 言

　　不论半自动生化分析仪(SAA)或全自动生化分析仪(TAA)采用的测定技术大多为吸收光谱分析,依据的Lamber--Beer定律成主的先决条件是单色光测定，选择波 长 的 原 则 是 反 应 指 示 物 吸 收 峰 对 应 的 波 长(Wavelength,以nm表示),从而避免或减少来自试剂空白和样品空白对测定光吸收的干扰，提高测定的特异度和灵敏度。

　　为了获得单色光,有的仪器使用全息衍射光栅,少数用玻璃棱镜制作的单色光器,波长连续可调,可准确选择吸收峰对应的波长。每个项目测定波长均可在配套使用的试剂盒说明书中查到,作为参数预先输入。但是,不论SAA 还是TAA 大多采用干涉滤光片,一般配有常用的6 — 8 种波长,个别高档大型TAA 配有12 种波长:340,380,410,450,480,520,540,570,600,660,750和800nm等。此时测定波长只能选择距吸收峰最近者。例如,双缩脲法测血清总蛋白产物吸收峰在550nm,即可选用相近的540nm 为测定波长。另一典型的例子是反应中测 NADH或NADPH 时,都选择其吸收峰340nm 为测定波长,在此波长二者对应的氧化型 NAD+或 NADP+的光吸收又很低,如图1所示。

　　以碱性磷酸酶(ALP)测定为例可见决定选用的波长时,要考虑多方面因素。ALP 底物对—硝基酚磷酸盐(4NPP)被ALP水解成产物对—硝基苯酚(4NP),二者吸收光谱如图2所示。4NP吸收峰在402nm,但在此波长来自底物4NPP 的背景光吸收明显,这会造成分析范围受限;如果选用410nm —420nm 为测定波长,4NP 的吸收尽管有所下降,但4NPP的光吸收下降更明显,二者差距拉大,有利于降低ANPP 干扰,并提高测定灵敏度和特异度;但在410nm —420nm 这段正是4NP 吸收谱线的倾斜段,仪器波长稍有偏移就会导致4NP 克分子消光系数较大变动,为避开这一弊端国际临床化学协会(IFCC)在建立ALP推荐方法时选择了405nm为测定波长,这样,一是靠近 4NP 吸收峰,同时又明显降低反应混合物起始光吸收,并且405nm 又是在光源真空汞灯较强的发射光谱之内,有利于提高仪器分析的灵敏度。

　　有时因技术上的原因,选择的测定波长不得不偏离待测成分的吸收峰。例如γ- 谷氨酰转肽酶(γ-GT)测定中,以γ-谷氨酰-3-羟基-4-硝基苯胺为底物,产物5氨基-2-硝基苯甲酸的吸收峰在380nm。但在此波长供体底物在反应混合物中会造成无法接受的高光吸收,如图3所示。随波长增加,底物和产物的光吸收都下降,但前者下降更明显,因此,选择410nm 为测定波长,测定光信号强度足够,可满足γ-GT 催化活性监测线性范围的需求,而试剂空白的光吸收也相当的低。

　　对带标准(校正)物的终点法和二点法测定待测物浓度，只要仪器测定波长稳定，即使波长准确性稍有偏差，因样品与标准(校正)物是在同一波长测定,灵敏度有所下降，但对最后结果影响不大。与此不同，使用 F 值计算酶活性的连续监测法对波长的准确性要求很高。因为用于计算F 值的指示物的克分子消光系数(ε)是在一定条件下相对于一定波长测得的,ε会因波长改变而变化,从而影响F 值的大小,使最后测定结果不可靠，在测定准确定值的参考血或质控血清时必然偏离靶值，如果参加室间质评调查，也将偏离可靠靶值。失去室间可比性。为避免因波长不造成的误差，定期核查和校正仪器波长，及时淘汰已老化、波长不准确的滤光片，对保证仪器分析结果的可靠性是重要的。近年国内已有不通过校正仪器自身的波长，而是设法测出指示物在实时的仪器波长下ε等方法进行酶活性测定的校正，对这些校正方法的科学性，实用性有待进一步探讨。