浅谈如何开发和验证高效液相色谱检测方法

　　0　引言

　　为了满足新产品质量控制的需要,或是对已经在用的检测方法进行不断改进的需要,保健食品生产企业需要不断地开发新检测方法,并对新开发的检测方法的科学性进行必要的验证。高效液相色谱法因应用范围广范,目前已成为药品、保健食品、化妆品生产企业最常用的检测方法之一。高效液相色谱方法开发和方法验证应按照一定的思路和要求进行,笔者通过对保健食品中大蒜素含量的测定方法(高效液相色谱法)的开发和验证过程的介绍,说明检测方法的开发思路和方法验证内容,为各实验室对检测方法的开发和验证提供参考。

　　1　方法开发思路

　　1·1　确立检测方法的技术路线

　　通过查阅、收集国内外有关大蒜素检测方法和文献了解到,大蒜素可用的检测方法有:液相法、气相法、紫外法、重量法等等,综合考虑各种检测方法的优缺点,高效液相法具有操作简单、使用成本较低、可适用于多种不同剂型的大蒜素产品中大蒜素的检测等优点,故拟定以高效液相色谱法测定大蒜制品中大蒜素的含量。

　　1·2　确定最佳样品前处理条件

　　1)提取溶剂的确定:从文献可知,大蒜素一般可溶于甲醇、乙醇、乙腈等溶剂,但大蒜素加入一定的辅料制成产品后,不同的溶剂对大蒜素溶出率却不尽相同,因此,要通过单因素试验考查不同溶剂对大蒜素溶出效率,并确定最佳的溶剂,当几种溶剂均可用时,要选择毒性低、价格便宜的作为提取溶剂,从不同溶剂对大蒜片提取效果的影响试验可知(见图1),无水乙醇是大蒜油菜的最佳的提取溶剂,用同样的方法,我们验证了无水乙醇是大蒜油和大蒜软胶囊的最佳提取溶剂。

　　注:在本文中:DATS为二丙烯基三硫醚,DADS为二丙烯基二硫醚,两者总和统称为大蒜素。

　　2)乙醇体积分数的确定:大蒜素液相法研究所用的样品类型有三种,分别为大蒜片(固体)、大蒜软胶囊(半固体)和大蒜油(液体),对乙醇体积分数的选择研究,采用了最有利于提取的液体样品进行研究,采用超声提取法,考察使用不同体积分数的乙醇进行提取时测定结果的变化。实验结果(见图2)表明,当乙醇体积分数为100%时,测定结果最大。确定采用无水乙醇对样品进行提取。

　　3)大蒜素提取方式的确定:通常,样品的提取方式有水浴提取和超声波提取,通过试验我们得知,两种提取方式对大蒜油的提取效率无太大差异,而大蒜片和大蒜软胶囊超声波常温提取提取30分钟的提取率比水浴50℃提取4小时的明显要高,故确定提取方式为超声波提取。

　　4)大蒜素提取温度的确定:以最难提取的剂型大蒜片作研研究,试验超声波在常温、30℃、40℃、50℃、60℃、65℃水浴下对大蒜片中大蒜素含量测定时发现,不同温度下大蒜素的检测结果基本一致,故确定提取温度为常温提取。见图3所示。