软X射线接触式显微术研究

　　1　引　　言

　　长期以来,光学显微镜和电子显微镜是研究生物样品结构的最常用工具。光学显微镜使用可见光照明,受衍射效应的影响,成像分辨率很难超过200 nm;电子显微镜具有极高的分辨率,但样品必须经过脱水、干燥、染色、超薄切片等处理,要研究活体生物样品具有极大的困难[1]。

　　软X射线可以穿透几个微米厚的生命物质,避免了生物样品的切片处理;同时,各元素在此波段存在大量共振态,可以通过选择波长得到满意的成像衬度,并可利用此区域的吸收限进行定量分析;特别是在氧的kα吸收限2.3 nm与碳的kα吸收限4.4 nm之间(一般称作水窗波段),水对软X射线的吸收比各种生命物质的吸收低一个数量级,这对于排除水的本底干扰,实现自然状态下的高分辨显微观察具有重要意义。正是软X射线显微术具有这些独特的优点,才使它有可能弥补光学显微镜和电子显微镜在研究活体生物样品时的不足。它的优点不在于分辨率有更高的突破,而在于能够研究自然状态下的尤其是活的生物样品[1]。

　　2　软X射线接触式显微术原理

　　软X射线与物质相互作用时,主要有弹性散射、非弹性散射和光电吸收三种作用形式。弹性散射和非弹性散射相对于光电吸收可以忽略,可以通过观察透过各分辨单元的软X射线的强度变化,来获得样品各分辨单元在光束传播方向的透过率变化,从而得知样品内部结构及成分等信息[2]。接触式显微术是目前软X射线成像方法中最简单也是分辨率最高的一种方法,其结构如图1所示。它是将样品紧贴在软X射线抗蚀膜上,然后以适当强度的软X射线进行曝光,对曝光后的抗蚀膜进行显影处理,便可在抗蚀膜表面获得反映样品结构的浮雕图形,最后通过光镜、电镜或原子力显微镜放大观察来获得样品的结构信息。

　　影响这种显微术分辨率因素有:衍射效应、半影模糊、光刻胶的分辨率、曝光量、辐射损伤等[1]。

　　3　实验方法

　　3.1　光源

　　在实验中采用改进型的Henke源[3],利用碳靶获得λ=4.4nm的软X射线。这种光源的强度较低,曝光时间较长,不利于生物样品成像。我们主要利用这种光源分析曝光量、显影条件及分辨率的关系,探索实验条件。

　　3.2　曝光量的确定

　　3.2.1　曝光量与衬度及信噪比的关系

　　接触式显微术是以均匀的软X射线照射生物样品,通过计量不同分辨单元透过的光子数而获得样品的细节特征。对于如图2所示的单衬度样品,当以波长为λ的软X射线入射时,要求曝光量

　　I1代表为分辨如图2所示的单衬度模型,每个分辨单元所需要的入射光子数,Tgrou为样品模型背景的透过率,t为分辨细节相对于背景的透过率,γ为信噪比,G为灰度[4,5]。生物样品的特点是具有复杂的结构及成分,具有多种衬度。因此,我们设计了一个多衬度样品模型,如图3所示。最高台阶代表样品内部最小透过率处,通过各台阶的不同排列组合可以得到不同的衬度。随着所需分辨细节的衬度的变化,可选择合适的台阶高度和间距进行讨论。我们此处只给出一种讨论的方法。为简化讨论,我们将生物样品模型的材料仅考虑为蛋白质。